تست بردفورد
تست بردفورد برای ارزیابی غلظت پروتئین تام در نمونه، مورد استفاده قرار می گیرد. اساس این روش، اتصال مولکول های پروتئین به رنگ کوماسی تحت شرایط اسیدی است که منجر به تغییر رنگ قهوه ای به آبی می شود. در واقع در این روش حضور اسیدهای آمینه بازی، آرژنین، لیزین و هیستیدین، که در شکل گیری کمپلکس رنگ- پروتئین نقش دارند، سنجش می شود. برخلاف روش BCA، عوامل کاهنده مانند DTT و بتا مرکاپتواتانول و شلاتورهای فلز مانند EDTA و EGTA در غلظت پایین، در این روش تداخلی ایجاد نمی کنند. با این حال، حضور SDS حتی در غلظت های پایین، می تواند در اتصال رنگ پروتئین تداخل ایجاد کند.
مواد و واکنشگرها
1. سرم آلبومین گاوی (BSA)
2. آبی کوماسی (G-250)
3. متانول
4. اسیدفوسفوریک (H3PO4)
5. واکنشگر بردفورد (دستورالعمل را ببینید)
تجهیزات
1. اسپکتروفوتومتر
2. کاغذ واتمن
روش کار
مراحل سنجش استاندارد (برای نمونه ای با 5-100 میکروگرم بر میلی لیتر پروتئین)
1. تهیه 5 تا 8 رقت از پروتئین استاندارد (معمولا BSA) با رنجی از 5 تا 100 میکروگرم پروتئین.
2. رقیق سازی نمونه پروتئین مجهول برای دستیابی به غلطت 5 تا 100 میکروگرم پروتئین در 30 میکرولیتر.
3. 30 میکرولیتر از هر محلول استاندارد یا نمونه مجهول را به لوله مناسب نشان دار شده اضافه کنید.
4. دو لوله بلانک تهیه کنید. برای منحنی استاندارد، 30 میکرولیتر آب را به جای محلول استاندارد اضافه کنید. برای نمونه مجهول، 30 میکرولیتر بافر تهیه پروتئین را جایگزین نمونه کنید. محلول های پروتئینی معمولا دو یا سه بار مورد ارزیابی قرار می گیرند.
5. یک و نیم میلی لیتر از معرف بردفورد را به هر لوله اضافه کنید و خوب تکان دهید.
6. سپس به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید. با گذشت زمان جذب افزایش خواهد یافت. نمونه ها نباید بیش از یک ساعت در دمای اتاق باقی بمانند.
7. جذب را در 595 نانومتر اندازه گیری نمایید.
مراحل سنجش در مقیاس میکرو ( مقدار پروتئین کمتر از 50 میکروگرم بر میلی لیتر)
1. تهیه 5 محلول استاندارد (1 میلی لیتر از هر کدام) شامل غلظت های 0، 10، 20، 30، 40 و 50 میکروگرم بر میلی لیتر BSA.
2. 800 میکرولیتر از هر محلول استاندارد و محلول نمونه ( حاوی پروتئین با غلظت کمتر از 50 میکروگرم بر میلی لیتر) را به یک لوله تمیز منتقل کنید. (محلول های پروتئنین معمولا 2 تا 3 بار ارزیابی می شوند).
3. 200 میکرولیتر از رنگ را به هر لوله اضافه و ورتکس کنید.
4. مراحل شرح داده شده در بالا را برای سنجش استاندارد انجام دهید.
دستورالعمل تهیه واکنشگر بردفورد
1. 50 میلی گرم رنگ آبی کوماسی G-250 را در 50 میلی لیتر متانول حل کنید و 100 میلی لیتر اسیدفوسفوریک (H3PO4) (85% وزنی / حجمی) به آن اضافه کنید. مخلوط اسیدی را به آرامی به 850 میلی لیتر آب اضافه کنید و اجازه دهید رنگ کاملا حل شود ( نکته: آب را به اسید اضافه نکنید).
2. سپس برای حذف رسوبات محلول را از کاغذ واتمن عبور دهید.
3. رنگ بدست آمده را در تاریکی و در دمای 4 درجه نگهداری کنید.
References
1. Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal Biochem 72: 248-254.
2. Stoscheck, C. M. (1990). Quantitation of protein. Methods Enzymol 182: 50-68.
How to cite: He, F. (2011). Bradford Protein Assay. Bio-protocol Bio101: e45. DOI: 10.21769/BioProtoc.45