جداسازی DNA از باکتری­های گرم منفی

 

در این پروتکل، جداسازی DNA از باکتری­ها بر پایه کاربرد سدیم دودسیل سولفات و پروتئینازK  برای لیز سلول­ها می­باشد. سپس DNA با وزن مولکولی بالا قطعه قطعه ( برای کاهش ویسکوزیته و کنترل بهتر روند جداسازی)، به وسیله فنول:کلروفرم استخراج شده، و با ایزوپروپانول رسوب داده می شود. DNA جداشده با این روش، طولی معادل 30 تا 80 کیلوباز دارد.

مواد

جهت مدیریت مناسب مواد مضر موجود در این پروتکل، ایمنی مواد آزمایشگاهی ذکر شده در Data Sheet باید مورد توجه قرار گیرد. برای دریافت پروتکل­های بیشتر، به صورت آنلاین، از لینک زیر استفاده نمایید.

http://cshprotocols.cshlp.org/site/recipes.

واکنشگرها

  • استات آمونیوم (5M)
  • محیط کشت باکتری (≥5mL)

محیط کشت باید یک شبانه روز همرا با شیک شدید انکوبه شود.

  • کلروفورم
  • اتانول (70% و 95%)
  • ایزوپروپانول
  • کلرید سدیم (5M,NaCl)
  • فنول:کلروفورم (1:1 حجمی/حجمی)
  • پروتئیناز K (20 میلی گرم / میلی لیتر در TE، pH برابر 7/5)
  • ریبونوکلئاز A (5 میلی گرم / میلی لیتر در TE، pH برابر 8)
  • SDS ( %10، وزنی / حجمی)
  • بافر TE، 10× <R> (pH 8.0)

تجهیزات

  • کووت جهت سنجش جذب در 260nm

کووت ها باید از نوع متیل آکریلات شفاف نسبت به UV (یک بار مصرف) و یا کوارتز باشند. قبل و پس از مصرف، کووت­ها را در Hcl: متانول (1:1 حجمی/ حجمی) به مدت 30 دقیقه غوطه کنید، و سپس به خوبی با آب استریل شستشو دهید.

  • سوزن، ضخامت-26  Needle, 26-gauge
  • اسپکتروفوتومتر
  • ساکشن وکیوم مجهز به محفظه
  • حمام آب، تنظیم شده در °37C

روش کار

  1. 1/5 میلی لیتر از محیط کشت باکتریایی (انکوبه شده به مدت یک شبانه روز) را به تیوب میکروسانتریفوژ منتقل کرده، سپس به مدت 30 ثانیه در دمای اتاق سانتریفوژ کنید. سوپرناتانت (محلول رویی) را به وسیله ساکشن حذف کنید.
  1. 400 میکرولیتر از بافر TE ( pH برابر 8) را اضافه کنید. رسوب باکتریایی را با استفاده از ورتکس (دو بار و هر بار به مدت 20 ثانیه) متفرق نمایید.
  1. 50 میکرولیتر از SDS %10 و 50 میکرولیتر از پروتئیناز K ( 20 میلی گرم / میلی لیتر در بافر TE، pH برابر 7/5) را اضافه کنید. لیزات باکتریایی را به مدت 1 ساعت در ° 37c انکوبه کنید.
  1. در این مرحله، لیزات هضم شده بسیار ویسکوز بوده و کار بر روی آن سخت است. DNA را با 3 تا 5 بار عبور دادن از سوزن با سایز 26، قطعه قطعه کنید. سعی کنید، میزان تولید کف حداقل باشد.
  2. 500 میکرولیتر از مخلوط فنول:کلروفرم (1:1) اضافه کنید.
  3. درب تیوب میکروسانتریفوژ را بسته و دو فاز را به وسیله ورتکس ملایم، مخلوط کنید.
  4. لایه فوقانی را به یک تیوب میکروسانتریفوژ دیگر منتقل کرده و مراحل 5 و 6 را دو یا سه بار تکرار کنید، تا زمانی که هیچ ماده ای در حدفاصل دیده نشود.
  5. فاز آبی را با 500 میکرولیتر کلروفرم (دو بار)، خارج کنید.
  6. سوپرناتانت را به تیوب میکروسانترفیوژ جدید منتقل کرده و 25 میکرولیتر از 5NaCl  مولار و 1 میلی لیتر اتانول 95% را اضافه کنید. سپس ورتکس کرده و سپس به مدت 10 دقیقه در °4C ساتریفوژ کنید.
  7. سوپرناتانت را خالی کنید، و سپس اتانول باقی مانده به دقت به وسیله یک میکروپیپت حذف کنید. تیوب را بدون در روی میز به مدت 15 دقیقه قرار دهید.
  8. رسوب نیمه مرطوب را در 100 میکرولیتر بافر TE (pH برابر 8) حل کنید، 5 میکرولیتر ریبونوکلئاز A ( 5 میلی گرم / میلی لیتر در بافر TE، pH برابر 8) را اضافه کنید. محلول را به مدت 30 دقیقه در دمای °37C  انکوبه کنید.
  9. 40 میکرولیتر استات آمونیوم 5 مولار و 250 میکرولیتر ایزوپروپانول را اضافه نمایید. کمی ورتکس کنید، و تیوب دربسته را به مدت 10 دقیقه در دمای اتاق قرار دهید.
  10. DNA را به وسیله سانتریفوژ (10 دقیقه در دمای اتاق) بازیابی کنید. رسوب را دوبار بار اتانول 70% بشویید. سوپرناتانت را بریزید، و سپس اتانول باقی مانده را به دقت با میکروپیپت حذف نمایید. تیوب در باز را به مدت 15 دقیقه برای روی میز رها کنید.
  11. رسوب نیمه مرطوب را در 100 میکرولیتر بافر TE (pH برابر 8) حل کنید. غلظت DNA را از جذب آن در رقت 1:10 از یک نمونه DNA (در آب) در 260 نانومتر تعیین کنید. برای بلانک، رقت 1:10 از بافر TE (pH برابر 8) در آب استفاده نمایید.
  1. بسته به نوع کاربرد، DNA را نگهداری کنید. DNA به طور نامحدود در ° 20C- یا در ° 4C در بافر TE (pH برابر 8) قابل نگهداری است. تفاوتی بین پایداری DNA ذخیره شده در ° 20C- و ° 80C- وجود ندارد. اما DNA نگهداری شده در آب خالص به هیدرولیز اسیدی حساس است. در ذخیره طولانی مدت DNA، برای جلوگیری از تبخیر باید درب تیوبها به خوبی و محکم بسته شوند.

بافر TE  (10X)

تریس -100HCL میلی مولار (pH مورد نظر)

10EDTA  میلی مولار ( pH برابر 8)

محلول را با اتوکلاو به مدت 20 دقیقه در فشار 15 psi استریل کنید.

بافر را در دمای اتاق ذخیره کنید.

References:

Isolating DNA from Gram-Negative Bacteria. http://cshprotocols.cshlp.org/content/2017/1/pdb.prot093369.short