تهیه ژل الکتروفورز SDS-PAGE

 

سیستم الکتروفورز  SDS-PAGE شامل: تانک، درب و کابل برق، بخش الکترودها، cell buffer dam، casting stands, casting frames,، شانه ها ( معمولا 10یا 15-چاهک)، صفحات شیشه ای (ضخامت 75/0 میلی متر یا 1 میلی متر یا 5/1 میلی متر) است. (مارک تجاری Bio-rad توصیه می­شود).

ژل SDS-PAGE را می­توان به دو بخش ژل متراکم کننده یا stacking gel  و ژل جدا کننده یا separating gel تقسیم نمود. ژل متراکم کننده (آکریل آمید 5%) در بالای ژل جداکننده ریخته می شود (پس از انجماد) و یک شانه ژل در ژل متراکم کننده قرار داده می­شود. درصد آکریل آمید در ژل SDS-PAGE به اندازه پروتئین هدف در نمونه، بستگی دارد. (جزئیات در زیر نشان داده شده است).

 

 Acrylamide %

وزن مولکولی

7%

50kDa – 500 kDa

10%

20kDa – 300 kDa

12%

10kDa – 200 kDa

15%

3kDa – 100 kDa

 

حجم­های ژل متراکم کننده و ژل جداکننده بسته به ضخامت ژل بوده متفاوت است:

 

 ضخامت ژل حجم ژل متراکم کننده حجم ژل جداکننده

0.75mm

2ml

4ml

1.0mm

3ml

6ml

1.5mm

4ml

8ml

 

 

برای 5 میلی لیتر ژل متراکم کننده:

 

 

H2O

2.975ml

0.5M Tris-HCl, pH 6.8

1.25ml

10% (w/v) SDS

0.05ml

Acrylamide/Bis-acrylamide (30%/0.8% w/v)

0.67ml

10% (w/v) Ammonium persulfate (AP)

0.05ml

TEMED

0.005ml

 

برای 10 میلی لیتر ژل جداکننده:

 

 Acylamide percentage

6%

8%

10%

12%

15%

H2O

5.2ml

4.6ml

3.8ml

3.2ml

2.2ml

Acrylamide/Bis-acrylamide (30%/0.8% w/v)

2ml

2.6ml

3.4ml

4ml

5ml

1.5M Tris(pH=8.8)

2.6ml

2.6ml

2.6ml

2.6ml

2.6ml

10% (w/v)SDS

0.1ml

0.1ml

0.1ml

0.1ml

0.1ml

10% (w/v) Ammonium persulfate (AP)

100μl

100μl

100μl

100μl

100μl

TEMED

10μl

10μl

10μl

10μl

10μl

 

توجه: آمونیوم پرسولفات (APS) و TEMED دقیقا قبل از هر بار عملیات، باید اضافه شوند.

بافر نمونه x5 (loading buffer) :

 

10%w/v

SDS

10mM

Dithiothreitol, or beta-mercapto-ethanol

  %20v/v

Glycerol

0.2M

Tris-HCl, pH 6.8

0.05%w/v

Bromophenolblue

 

از حل شدن پروتئین هدف در فاز مایع و عدم حضور اجزا نامناسب اطمینان حاصل کنید ( گوانیدین هیدروکلراید با SDS می تواند برهمکنش کند و سبب رسوب شود)، عموما، برای تیمار نمونه آماده نشده، می توانید سونیکیتور، بافر لیز یا هردو را برای آزادسازی پروتئین هدف خود استفاده کنید، سپس برای اطمینان از جداشدن رسوب و سوپرناتانت آن را سانتریفوژ کنید.

 

1x Running Buffer:

 

25mM

Tris-HCl

200mM

Glycine

0.1%(w/v)

SDS

 

(بسته به نوع سیستم الکتروفورز شما، حدودا حجمی کمتر از یک لیتر مورد نیاز است).

 

پروتکل SDS-PAGE

1- ساخت ژل جداکننده:

casting frame ها را روی casting stand ها ( دو صفحه شیشه ای را در casting frame محکم کنید) قرار دهید. محلول ژل را در ظرفی مجزا آماده کنید (همانطور که در بالا شرح داده شد). محلول را به آرامی اما به طور کامل بچرخانید. مقدار مناسبی از محلول ژل جداکننده (لیست شده در بالا) را به درون فاصله بین صفحات شیشه ای پی پت کنید. برای اینکه بالای ژل جداکننده را تراز کنید، فاصله را با آب (یا ایزوپروپانول) پر کنید. 20 تا 30 دقیقه منتظر بمانید تا ژل ببندد.

ساخت ژل متراکم کننده:

آب را بیرون بریزید، اکنون شما می­توانید ژل جداکننده را کنار بگذارید. ژل متراکم کننده را تا سرریز شدن آن پی پت کنید. شانه با فرم مناسب را بدون اینکه هوا در زیر دندانه ها به دام بیافتد، جایگذاری کنید. 20 تا 30 دقیقه منتظر بمانید تا ژل ببندد.

2-  پس از اطمینان از بسته شدن ژل متراکم کننده، شانه را خارج کنید. صفحات شیشه ای را از casting frame خارج کرده و  آن­ها را در cell buffer dam قرار دهید.  بافر الکتروفورز (running buffer) را به درون محفظه داخلی بریزید، این کار را ادامه دهید تا سطح بافر به سطح مورد نیاز در محفظه خارجی برسد.

3- آماده سازی نمونه

نمونه های خود را با بافر نمونه مخلوط کنید (loading buffer)

آنها را در آب جوش به مدت 10-5 دقیقه حرارت دهید.

4-  نمونه آماده شده را روی چاهک ها بارگزاری کنید و از عدم نشت آن اطمینان حاصل کنید. مارکر پروتئینی را در اولین چاهک لود کنید. درپوش را قرار دهید و آنودها را متصل سازید.

5- ولتاژ مناسب را تنظیم کنید و الکتروفورز را اجرا کنید.

هنگامی که پروتئین مارکر با کمترین وزن مولکولی به خط پایینی صفحه شیشه ای نزدیک می شود،  الکتروفورز متوقف می شود؛ معمولا،  1 ساعت با ولتاژ 120 ولت و و ژل جداکننده 12% . برای ژل جداکننده با درصد بالاتر آکریل آمید، زمان الکتروفورز طولانی تر خواهد بود.

توجه: بسیاری از فاکتورها بر نتیجه ژل تاثیرگذارند.

غلظت های بالاتر آمونیوم پرسولفات و TEMED منجر به تشکیل سریعتر ژل ، و از طرف دیگر، پایداری و کش­سانی پایین تر خواهد شد.

دمای بهینه برای تشکیل ژل 23 تا 25 درجه سانتیگراد است. دمای پایین تر منجر به ژل کدر، متخلخل و غیر کش­سان می شود.

pH بهتر است خنثی باشد و زمان تشکیل ژل به 20 الی 30 دقیقه محدود شود.

 

1

References

 

http://www.assay-protocol.com/molecular-biology/electrophoresis/denatur