شناسایی قطعه قطعه شدن DNA در سلول­های آپوپتوزی به وسیله تست  TUNEL

تخریب قطعات DNA به قطعاتی با اندازه الیگونوکلئوزومی، رخدادی منحصر به فرد در آپوپتوز است که با DNase فعال شده به وسیله کاسپاز، انجام می­شود. به طور مرسوم، این رخداد با جداسازی DNA سلولی به وسیله ژل الکتروفورز، که منجر به ظاهر شدن الگوی نردبانی (ladder pattern) می­شود، قابل مشاهده می­گردد. با این وجود، این تکنیک زمان بر است و برای تعیین تعداد سلول­های آپوپتوزی در یک نمونه قابل استفاده نیست. تست TUNEL (Terminal dUTP nick-end labeling)، تعیین قطعه قطعه شدن DNA را در سطح سلول منفرد امکان پذیر می سازد. این روش شامل افزودن UTP نشان گذاری شده به صورت فلورسانس به انتهای /3 قطعه DNA، به وسیله داکسی نوکلئوتیدیل ترانسفراز انتهایی است. تست TUNEL سریع و حساس است. در اینجا، ما پروتکلی را شرح خواهیم داد که در آن سلول­ها با  واکنشگر TUNEL تیمار شده و به صورت متضاد با Hoechst 33342 رنگ می شود. بر خلاف TUNEL، که فقط سلول های آپوپتوزی را رنگ آمیزی می کند، Hoechst 33342، DNA تمام سلول ها را رنگ می کند.

مواد:

جهت مدیریت مناسب مواد مضر موجود در این پروتکل، ایمنی مواد آزمایشگاهی ذکر شده در Data Sheet باید مورد توجه قرار گیرد. برای دریافت پروتکل­های بیشتر، به صورت آنلاین، از لینک زیر استفاده نمایید.

http://cshprotocols.cshlp.org/site/recipes.

واکنشگرها:

سلول های مورد نظر

بافر سیترات (تریتون X100 1/0 % در سیترات سدیم 1/0 %)

عامل سایتوتوکسیک منتخب

Hoechst 33342 (Sigma-Aldrich)

Hoechst 33342 را می توان با DAPI، ProLong Gold Antifade with DAPI ، یا پروپیدیوم یدید جایگزین کرد.

این رنگ ها به DNA متصل می شوند و باید جهش زا در نظر گرفته شوند.

کیت ردیابی مرگ سلولی در جایگاه (Roche Diagnostics 11684795910)

کیت شامل یک محلول نشاندارشده (شامل نوکلئوتیدهای نشان دار شده به صورت فلورسنس) و یک محلول آنزیمی (داوکسی نوکلئوتیدیل ترانسفراز انتهایی  [TdT]) است.

پارافرم آلدهید (PFA) (4%) در PBS <R>

Paraformaldehyde (PFA) (4%) in PBS

بافر سالین فسفات (PBS)  <R>

ProLong Gold Antifade  (تکنولوژی های زیستی)

تجهیزات:

میکروسکوپ فلورسانس

روش کار:

1- سلول های مورد نظر را با عوامل سایتوتوکسیک تیمار کنید. (پروتکل های زیر را ببینید.)

Triggering Apoptosis in Hematopoietic Cells with Cytotoxic Drugs (Crowley et al. 2015c)) و یا پروتکل (Triggering Death of Adherent Cells with Ultraviolet Radiation ([Crowley et al. 2015d]))؛ سپس، سلول ها را با PFA 4% به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق فیکس کنید. سلول های چسبنده می توانند مستقیما در PFA فیکیس شوند. سلول های غیر چسبنده، باید کشت داده شوند و به لامل متصل شوند (پروتکل زیر را ببینید)

Morphological Analysis of Cell Death by Cytospinning Followed by Rapid Staining [Crowley et al. 2015b]

 

2- سلول ها را دو بار با PBS، هر بار به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق بشویید. پیپتاژ یا آسپیره کردن PBS. برای جلوگیری از آسیب سلول ها مانع تماس سلول ها با پیپت شوید.

3-  سلول ها را با انکوباسیون آنها در بافر سیترات، بر روی یخ به مدت 2 دقیقه، نفوذپذیر سازید.

4- سلول ها را دو بار با PBS، هر بار به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق بشویید. پیپتاژ یا آسپیره کردن PBS. برای جلوگیری از آسیب سلول ها مانع تماس سلول ها با پیپت شوید.

5- آماده سازی واکنشگرهای TUNEL به وسیله مخلوط کردن 5 میکرولیتر از محلول آنزیمی با 45 میکرولیتر از محلول لیبل به ازای هر اسلاید. 50 میکرولیتر از مخلوط واکنشگر TUNELرا به ازای هر اسلاید اضافه کنید و اسلاید را با پارافیلم یا یک لامل برای  اطمینان از آغشته شدن  سلول­ها، بپوشانید. در تاریکی در یک انکوباتور مرطوب به مدت 1 ساعت در °37C انکوبه کنید.

  • واکنشگر TUNEL باید قبل از کاربرد و به صورت تازه تهیه شود. واکنشگر به نور حساس بوده و در تمام مراحل باید دور از نور نگهداری شود.
  • رنگ آمیزی کنترل منفی بر روی اسلاید کنترل با استفاده از 50 میکرولیتر از محلول نشانگر بدون محلول آنزیمی انجام شود.

شکل 1- نمودار مربوط به مراحل مختلف تست TUNEL

 

تست تانل

 

متغیر

تیمار سلول ها با عوامل سایتوتوکسیک و فیکس در PFA 4%

1

10 دقیقه

شستن سلول ها دو بار با PBS

2

2 دقیقه

نفوذپذیرسازی سلول ها با تریتون X-100 1/0%

3

10 دقیقه

شستن سلول ها دو بار با PBS

4

1 ساعت

انکوباسیون سلول ها با مخلوط واکنشگر تانل در تاریکی

5

10 دقیقه

شستن سلول ها دو بار با PBS

6

15 دقیقه

انکوباسیون سلول ها با Hoechst 33342 در تاریکی

7

10 دقیقه

شستن سلول ها دو بار با PBS

8

10- 5 دقیقه

شستن سلول ها دو بار با آب

9

یک شبانه روز

ثابت کردن سلول ها با ProLong Gold antifade

10

1 ساعت

تصویر برداری از سلول ها با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس

11

 

6- واکنش­گرهای TUNEL را با آسپیراسیون حذف کنید. سلول ها را دو بار با  PBS، هر بار 5 دقیقه در دمای اتاق بشویید.

7- سلول ها را با Hoechst 33342 (100 نانوگرم/میلی لیتر در PBS) در تاریکی برای 15 دقیقه در دمای اتاق انکوبه کنید.

شدت رنگ به وسیله انکوباسیون اسلایدها در رنگ در دوره های زمانی متفاوت، می تواند تغییر کند.

8- سلول ها را دو بار با  PBS، هر بار 5 دقیقه در دمای اتاق بشویید. PBS را پیپت و آسپیره کنید.

برای جلوگیری از آسیب سلول ها مانع تماس سلول ها با پیپت شوید.

9- سلول ها را با آب بشویید.

10-سلول ها را با واکنش گر ProLong Gold Antifade ثابت کنید و با یک لامل بپوشانید.

11- یک شبانه روز در تاریکی و در دمای اتاق قرار دهید. اسلایدها را فورا با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس ببینید و یا در تاریکی نگهداری کنید.

نشانه گذاری ،TUNEL نشان می دهد که شکست های رشته DNA در آن سلول ها اتفاق افتاده است. در مقابل، سلول هایی که فقط با Hoechst 33342 رنگ شده اند (نه با TUNEL)، شکست­های رشته DNA را ندارند. شمار سلول­های رنگ آمیزی شده با هر دوی  TUNEL و Hoechst 33342 (آپوپتوزی)، در مقابل شمار سلول­های رنگ شده با Hoechst 33342 به تنهایی (سالم)، برای تعیین سطح آپوپتوز در یک نمونه مورد استفاده قرار گیرد. تصویر سلول ها با استفاده از یک میکروسکوپ فلورسنس مجهز به دوربین می تواند گرفته شود و برای نمایش گرافیکی شمارش شود. سلول های رنگ شده با TUNEL، می توانند به وسیله فلوسایتومتری ارزیابی شوند. اگر تحلیل با استفاده از فلوسایتومتری مورد نظر است، بهتر است از متخصص در این زمینه کمک گرفته شود.

بحث:

قطعه قطعه شدن DNA در مقیاس بالا،  به قطعات با وزن مولکولی بالا و اندازه نوکلئوزومی، عموما مارکری برای مرگ سلولی از نوع آپوپتوزی است. تست TUNEL برای ردیابی این شکست ها ایده آل است. با این حال، از آنجاییکه تخریب DNA در اواخر مرگ سلولی ناشی از نکروز نیز دیده می شود و همچنین  آپوپتوز در غیاب قطعه قطعه شدن هسته می تواند رخ دهد، این تست کاملا معتبر نیست. بنابراین سنجش ثانویه ای مانند(annexin V binding, cytochrome c release, or caspase activation)  در ترکیب با سنجش TUNEL برای تشخیص سلول­های آپوپتوزی از سلول­هایی که در در اواخر فاز نکروز هستند مورد نیاز است. همچنین تست TUNEL با استفاده از نوکلئوتیدهای نشان دار شده با فلوروفورهای متفاوت قابل انجام است، که به محققین این امکان را می دهد تا TUNEL را در ترکیب با ایمونوسیتوشیمی، به منظور بررسی دیگر وقایع آپوپتوز، ترکیب کنند.

Reference:

Cold Spring Harbor Protocols

http://cshprotocols.cshlp.org/content/2016/10/pdb.prot087221.abstract